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giovedì 12 giugno 2008

UNO SGUARDO ALLA NANOSFERA 4

La risoluzione raggiungibile con i microscopi a luce - il limite di diffrazione - è normalmente ristretto a circa la metà della lunghezza d'onda della luce visibile, ovvero circa 200 nanometri. Se due oggetti sono più vicini rispetto a questa distanza non possono essere distinti e appaiono come un'unica struttura. La microscopia elettronica, che sfrutta lunghezze d'onde più corte, riesce a visualizzare dettagli più piccoli, ma è limitato a immagini in bianco e nero e a campioni molto sottili.

Il team di Heinrich Leonhardt, del Center for Integrated Protein Science alla Ludwig Maximilians University di Monaco, in Germania, in collaborazione con il gruppo di John Sedat della University of California di San Francisco, ha sviluppato un nuovo trucchetto per bypassare il limite di diffrazione: mediante interferenze causate da fasci di luce strutturati puntati sul campione, è possibile estrarre informazioni sulla sua forma, con l'aiuto dei computers, anche senza visualizzarla direttamente. "Abbiamo aperto la porta verso un nuovo mondo di nanostrutture che possono essere studiate anche senza essere viste", ha detto Leonhardt.

(Credit: Lothar Schermelleh and Peter Carlton)

Con questo metodo, i ricercatori sono riusciti a creare immagini ad alta risoluzione di cellule di topo che erano state marcate con tre diversi colori fluorescenti in modo da tracciare il DNA, l'involucro nucleare e i pori attraverso cui le molecole sono trasportate dentro e fuori il nucleo. Con questo nuovo approccio, in futuro sarà possibile studiare più dettagliatamente come i cromosomi e altri componenti subcellulari sono strutturati nello spazio, distinguendo le regioni di DNA con geni attivi da quelle con geni inattivi.

"Possiamo già immaginare strutture più piccole di 40 nanometri in 3D perfino in cellule viventi", ha detto Volker Westphal del Max Planck Institute for Biophysical Chemistry di Göttingen, in Germania.

(articolo di riferimento: Science, vol 320, p1332)

Un analogo nuovo sistema messo a punto da Roberto Cerbino del Dipartimento di Chimica, Biochimica e Biotecnologie per la Medicina dell'Università di Milano, e da Veronique Trappe del Dipartimento di Fisica dell'Università di Fribourg, Svizzera, chiamato "Differential Dynamic Microscopy" (DDM), è stato possibile misurare il movimento di oggetti nanoscopici aggirando il limite di diffrazione.

Come spiegato dagli autori su Physical Review Letters, la tecnica DDM, grazie all’analisi di immagini digitali, consente di far emergere dal rumore di fondo solo il segnale cercato, separandolo da tutte le interferenze, e di misurare esclusivamente le proprietà dinamiche delle particelle. Il tutto mediante l’uso di un comune microscopio in luce bianca equipaggiato con una telecamera.

Secondo i ricercatori, le applicazioni possono essere numerose in diverse discipline: dalla misura indiretta delle dimensioni e della forma di nano-oggetti, alla misura delle proprietà elastiche delle cellule, alla caratterizzazione dello stato di “invecchiamento” di yogurt e latticini. “Grazie alla sua semplicità”, ha commentato Cerbino, “ci aspettiamo che la tecnica DDM si diffonda in modo molto capillare nei molti laboratori che già possiedono la strumentazione necessaria”.

Paul O’Shea, un biofisico della University of Nottingham, Michael Somekh, un ingegnere ottico dell'Institute of Biophysics, Imaging & Optical Science di Nottingham e William Barnes, professore di fotonica alla University of Exeter, stanno sviluppando delle nuove tecniche per visualizzare sistemi biologici complessi a livello sub-cellulare (il loro lavoro è stato descritto sul numero di giugno di Physics World).

Se alcune cellule viventi sono più grandi di 80 micrometri, molti processi cellulari come le comunicazioni tra cellule, si svolgono a dimensioni inferiori a un micrometro, irraggiungibili dalle tecniche di imaging tradizionali come la microscopia a fluorescenza - che utilizza microscopi ottici per osservare strutture biologiche "taggate" con molecole fluorescenti che emettono fotoni quando irradiate da luce con una particolare lunghezza d'onda - che arrivano ad offrire una risoluzione al massimo di 200 nanometri.

Per estendere ulteriormente la vista di questi microscopi verso l'infinitamente piccolo, si stanno provando metodi come la "Stimulated Emission Depletion Microscopy" (STED), la "Stochastic Optical Reconstruction Microscopy" (STORM), la "Photo-Activated Localization Microscopy" (PALM) ed altri tipi di microscopia con illuminazione strutturata capaci di visualizzare strutture di circa 50 nanometri superando i limiti dovuti agli effetti di diffrazione luminosa.

La STED riduce le dimensioni della regione eccitata usando pulsazioni brevi immediatamente seguite da una pulsazione di deplezione (diminuzione) che causa una emissione stimolata che fa muovere gli elettroni dallo stato eccitato (che provoca la fluorescenza) ad uno a più bassa energia. In questo modo si riesce a lasciare nello stato eccitato solo una certa regione del campione, quella più vicino all'asse del fascio di deplezione.

Impiegando la STED, nel 2006, un gruppo di ricercatori del Dipartimento di Nano-Biofotonica dell’Istituto Max Plank per la Chimica Biofisica di Gottingen, ha studiato il processo di riciclo delle vescicole sinaptiche mediante un anticorpo fluorescente, la sinaptotagmina I (Willig K. I., et al. "STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis". Nature 440, 935-939, 2006).

(Credit: Xiaowei Zhuang)

Nell'agosto del 2007, la professoressa di Chimica, Biologia Chimica e Fisica alla Harvards University Xiaowei Zhuang, insieme al suo gruppo ha creato un assortimento di sonde fluorescenti che offrono grande flessibilità all'utilizzo di tecniche di microscopia fluorescente per focalizzare singole molecole, di DNA o RNA, all'interno di cellule con una risoluzione nanometrica di circa 20-30 nanometri

Il team della Zhuangf ha utilizzato la microscopia STORM che usa sonde fluorescenti che possono essere comandate da specifiche lunghezze d'onda. In particolare, le sonde usate dalla Zhuang consistono di due coloranti: uno, chiamato "photoswitchable reporter", che emette luce; l'altro, chiamato "activator", che attiva il primo. Combinando tre emittenti con tre attivatori, hanno creato nove diversi colori. Il colore della luce che attiva la sonda è determinato dall'attivatore mente il colore della luce emessa è determinato dal reporter. In questo modo, sono riusciti a visualizzare dei microtubuli - strutture lunghe e cilindriche che contribuiscono a determinare la struttura della cellula - e simultaneamente delle proteine rivestite di vescicole sulla superficie della cellula - usate per spostare molecole dall'ambiente esterno a quello interno della membrana - attaccando una coppia reporter-attivatore ai microtubuli e un'altra alle proteine.

Un team composto da ricercatori delle Università di Pechino e Honk Kong ha realizzato una corona dorata con un diametro di qualche nanometro formata da una molecola ad anello contenente 36 atomi d'oro (il lavoro è apparso su Angewandte Chemie).

Gli anelli molecolari affascinano i chimici da più di 40 anni, da quando sono stati scoperti nel 1967 da C. J. Pederson, J.-M. Lehn e D. J. Cram che per questa scoperta hanno ricevuto un Premio Nobel nel 1987. Da allora, questo tipo di sistemi molecolari sono giunti a rivestire un ruolo molto importante nella ricerca di nuovi materiali funzionali e nella nanotecnologia. La sintesi di tali sistemi tenuti insieme esclusivamente da legami tra metalli è ancora una sfida da vincere.

Piccoli anelli composti da atomi d'oro carichi positivamente erano già conosciuti, ma solo recentemente il team cinese era riuscito a creare un anello contenente 16 atomi d'oro. Il gruppo di ricercatori guidato da Shu-Yan Yu, Yi-Zhi Li e Vivian Wing-Wah Yam ha realizzato il primo esemplare di una nuova classe di questi composti: un sistema formato da 36 atomi d'oro univalenti.

I ricercatori sono partiti da un sistema a sei atomi formato da tre coppie di atomi collegate triangolarmente forzato da tre leganti organici a formare una molecola somigliante ad un'elica a tre pale. Sei molecole-elica dello stesso tipo sono state poi collegate in modo da formare un anello mediante un processo di auto-assemblaggio. Alla fine, gli atomi dorati, sei triangoli doppi legati l'uno all'altro a due angoli, hanno assunto una forma che ricorda molto quella di una corona.

(Articolo di riferimento "Au36 Crown: A Macrocyclization Directed by Metal–Metal Bonding Interactions". Angewandte Chemie International, Edition 2008, 47).

Per la prima volta, un virologo e un biochimico della Rockefeller University di New York, hanno visto, in tempo reale, centinaia di migliaia di molecole unirsi, in una cellula, per formare una specifica particella di un virus che, in meno di 25 anni, ha ucciso oltre 25 milioni di persone: l'Hiv, il virus dell'Aids (il lavoro è stato pubblicato su Nature).

La differenza l'ha fatta il microscopio usato dai due ricercatori: uno speciale tipo - Total Internal Reflection Microscopy (TIRM) - che illumina soltanto la superficie delle cellule, dove l'Hiv si assembla. La tecnica su cui si basa la TIRM è una tecnica ottica per monitorare la distanza di separazione istantanea tra una sfera microscopica e una lastra piatta in cui si verificano le "fluttuazioni Browniane", anche inferiori ad uno nanometro (scoperte dal botanico inglese Robert Brown nel 1827 mentre osservava il moto del polline in una sospensione acquosa). Per determinare questa distanza, si misura l'intensità della luce sparsa dalla sfera quando è illuminata da un' "onda evanescente" (che decade esponenzialmente rispetto la distanza) sfruttando il fenomeno detto di "riflessione totale interna".

In pratica, "è possibile vedere, in ogni minimo dettaglio, tutto ciò che avviene sulla superficie cellulare, escludendo il resto", spiega il biofisico Sandy Simon. L'équipe ha potuto così vedere per la prima volta quanto tempo impiega il virione, cioè la singola particella dell'Hiv, ad assemblarsi: appena cinque o sei minuti. "Prima - afferma il virologo Nolwenn Jouvenet - non sapevamo se ci volessero frazioni di secondo oppure ore".

Per essere certi che si trattasse di particelle in assemblamento sulla superficie cellulare - e non già formate - l'équipe ha etichettato una proteina virale "chiave", chiamata "Gag", con molecole fluorescenti, il cui colore cambia nel momento in cui si attaccano l'una all'altra. Molti differenti elementi servono per formare un virione, ma Gag è l'unica necessaria. I ricercatori hanno visto che le molecole di Gag vengono reclutate dall'interno della cellula e viaggiano verso la superficie. Quando ci sono abbastanza molecole vicine che si urtano l'una con l'altra, la membrana esterna della cellula comincia a gonfiarsi: è una sorta di bozzolo da cui si forma la singola particella virale, che diventa presto indipendente. Non scambia più materiale con la cellula e, anzi si stacca, pronta per infettarne altre.

(Credit: Graphic/Wen Jiang lab)

Utilizzando una tecnica di Criomicroscopia Elettronica a Singola Particella (Single-Particle Electron Cryomicroscopy), un team della Purdue University ha ottenuto immagini dettagliate di un virus ad una risoluzione di 4.5 angstroms, due volte maggiore di quelle ottenute in precedenza.

Nella criomicroscopia elettronica, il campione (un volume molto piccolo di soluzione acquosa) è congelato molto velocemente mediante immersione in etano liquido. L’acqua vetrifica (non cristallizza) e blocca ogni movimento del campione. Durante tutta la misura il campione deve essere mantenuto a temperatura bassa (–70 °C) ed osservato per poco tempo per non essere danneggiato. In genere, il campione non è colorato con alcun metallo pesante, per cui il contrasto delle immagini è molto basso. La risoluzione è però molto alta e ricostruendo matematicamente l’immagine a fuoco si ottengono micrografie con dettaglio molto fine. Registrando poi coppie di immagini a diverse angolazioni si ottiene una immagine tridimensionale del campione.

In questo modo, i ricercatori sono riusciti a produrre un’immagine 3D di "Epsilon15", un batteriofago (un virus che parassita un determinato batterio, di cui può provocarne la distruzione per lisi), una delle forme di vita più abbondanti sulla Terra. «Questo è uno dei primi progetti che arriva ad una risoluzione vicina al livello atomico», ha detto Wen Jiang, professore di Scienze Biologiche alla Purdue che ha condotto il lavoro, "non si erano mai osservati organismi di questa dimensione ad una tale risoluzione" .

Grazie a questa nuova scoperta si può vedere con precisione di dettaglio e risoluzione mai vista prima ed è quindi possibile andare a indagare strutture viventi per studiare ad esempio come i virus agiscano nell’organismo andando a infettare le cellule.

(Credit: Johan Mauritsson, Lund University)

Un lampo di luce dalla durata di un attosecondo: quanto basta per fotografare un elettrone. È quanto sono riusciti a fare nei laboratori di Ingegneria della Lund University, un ateneo svedese situato nell'omonima cittadina.

"Un attosecondo sta ad un secondo come un secondo sta all'età dell'universo", spiega Johan Mauritsson, professore della cattedra di Fisica Atomica dell'università scandinava, “occorrono 150 attosecondi ad un elettrone per compiere una rivoluzione attorno al nucleo, ma fino ad oggi nessuna tecnologia era stata in grado di scendere sotto il limite del femtosecondo”.

Le immagini ottenute fino ad oggi risultavano tutte "mosse": impossibile fermare il moto della particella, troppo veloce per le tecniche convenzionali. La tecnica impiegata dal team di Mauritsson ha utilizzato un fascio laser intermittente direzionato verso un fascio laser infrarosso continuo: in questo modo, è possibile "estrarre" un singolo atomo di elio dal flusso, ionizzandolo, osservando il suo movimento e tentando di catturare gli eventuali elettroni che si liberino dalla morsa atomica.

Il risultato è stato l'immagine di una specie di ciambella blu, ricavata dal detector che intercetta gli elettroni in uscita, con al centro, vuoto e buio, un singolo elettrone.

(Credit: David Muller Cornell Univesity)

Un nuovo Scanning Transmission Electron Microscope (STEM) installato recentemente alla Cornell Univesity, ha permesso agli scienziati per la prima volta di formare immagini a colori che identificano singoli atomi in un cristallo e mostrano come si legano l'uno all'altro (il lavoro è stato descritto su Science).

"I microscopi elettronici di moderna generazione sono una specie di costosissime fotocamere in bianco e nero che ritraggono gli atomi in differenti variazioni di grigio", spiega David Muller, professore associato alla Cornell di Fisica Ingegneristica e Applicata, "il microscopio che abbiamo utilizzato invece fornisce immagini a colori dove ogni atomo colorato rappresenta una particolare specie chimica".

Il nuovo strumento, realizzato dalla compagnia NION di Kirkland grazie a incentivi della National Science Foundation (NSF), incorpora una nuova tecnologia di correzione dell'aberrazione cromatica, dovuta al diverso valore di rifrazione delle diverse lunghezze d'onda che compongono la luce che passa attraverso il mezzo ottico, che consente di concentrare un fascio di elettroni su una regione più piccola di un singolo atomo in modo più preciso e con maggiore intensità, ricavando informazioni che in precedenza rimanevano nascoste nel "rumore" di fondo. Inoltre, con una maggiore velocità (nei primi test, ha ricavato un'immagine da 4,096-pixel in circa 30 secondi, da 50 a 100 volte più velocemente degli STEM convenzionali).

Gli scienziati hanno potuto così scrutare all'interno di un materiale e osservarne la composizione atomica, là dove regnano gli effetti quantistici. Una delle più importanti applicazioni che il nuovo strumento renderà possibili sarà lo studio della "patologia dei materiali" che aiuterà i ricercatori a sviluppare nuovi materiali da usare in circuiti elettronici, memorie di computer e per vari nanodispositivi.

Scienziati del Jet Propulsion Lab, in California, hanno sviluppato una nuova tecnica per sondare nanostrutture depositando nanoparticelle sulla zona direttamente interessata localizzabili mediante la spettroscopia Raman. Oltre che per visualizzare nanomateriali, la tecnica potrà essere utilizzata per analizzare strutture organiche fossili, perfino per campioni provenienti da altri pianeti (il lavoro è stato descritto su Applied Phisycs Letters).

Il nuovo metodo è stato chiamato da Mark Anderson "Targeted Surface Enhanced Spectroscopy" (TSES). Anderson ha usato un Microscopio a Forza Atomica per depositare nanoparticelle direttamente sul campione. Le ha poi illuminate con uno spettrofotometro concentrando la luce su determinate aree della superfici.

La tecnica consente di analizzare nanodispositivi o nanomateriali ma anche di realizzare nanostrutture plasmoniche dalle forme perfette.

Nel 2006, scienziati del Laboratory for Nanophotonics di Houston della Rice University hanno creato nanoparticelle a forma di chicchi di riso - "nanorice" - che accrescono i campi elettromagnetici attraverso l'azione dei plasmoni, ovvero delle eccitazioni ottiche accoppiate all'oscillazione del plasma degli elettroni, ottenendo così una alta sensitività che può essere utilizzata per la creazione di materiali applicabili nel campo dei sensori e delle tecniche di imaging.

Inoltre, nei piani di Anderson e del suo team, ci sono ulteriori sviluppi relativi all'analisi sub-micoscopica di fossili antichi, magari di quelli provenienti da Marte. Non a caso, il lavoro è finanziato dal Planetary Instrument Development Program della NASA che ha già dotato la sonda Phoenix, da poco atterrata sul suolo marziano, di un "Atomic Force Microscope" (AFM) con il compito di analizzare il suolo e la polvere.

Si tratta del primo, storico, atterraggio di uno strumento nanotecnologico su un altro pianeta.


Nanoscope peers beyond the limits of light (video)

Leonhardt lab

Department of NanoBiophotonics, Max Planck Institute

Zhuang lab research

Institute of Biophysics, Imaging and Optical Science

Jet Propulsion Laboratory

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